Mutazioni, come si cambia

...dopo tanto, troppo tempo rieccomi qui, a parlare di mutazioni, fattore importantissimo per le nostre lunghe catene acide…..

Questo è uin argomento molto importante, in quanto, siano esse naturali, che indotte influenza tantissimo il nostro corpo o quello che sarà la nostra prole… il futuro!

Vi  sono due principali tipi di cambiamenti del materiale genetico; le mutazioni cromosomiche, che cambiano l’intero chr o parti di esso  e mutazioni puntiformi, cambiamenti che riguardano solo una o poche coppie di basi. Una mutazione puntiforme non cambierà il fenotipo di un organismo a meno che non avvenga in un gene o in una sequenza di controllo del gene. Quindi le mutazioni hanno rivestito una particolare importanza in quanto si ha un cambiamento della proteine. Nella prima parte del secolo vi erano due scuole di pensiero opposte, quella Lamarkiana, dove la variazione era indotta dall’ambiente ed era ereditabile, e la scuola degli adattamenti casuali che alcune volte hanno un carattere adattativo. Un esempio lo vediamo nel batterio E.coli , che patisce la virulenze del fago T1, dove per la prima scuola di pensiero, il batteri che sopravvivevano era dovuto al fatto che si erano adattati ad esso, mentre per la seconda scuola, che in una popolazione di cellule sufficientemente alta ci fossero dei batteri con una mutazione casuale,resistenti al T1,  che però era selezionata solo in presenza del fago. L’acquisizione della resistenza dal fago T1 fu utilizzata da Salvator Luria e Max Delbruck nel 1943 per dimostrare la correttezza della teoria della mutazione spontanea. Il test da essi inventato, chiamato test di fluttuazione, è basato sull’idea che i due diversi meccanismi avrebbero dato origine a frequenze diverse di batteri resistenti in uno steso campione di cellule. Assumendo che il fago venga aggiunto dopo 4 generazioni vi sarebbero 16 cellule (n° di esempio non reale) se la teoria dell’adattamento fosse giusta, dovrebbero esserci tutte cellule dello stesso tipo, mentre se fosse vera la teoria della mutazione spontanea avremmo un numero di cellule, nella quarta generazione, resistenti al fago T1, dipenderebbe da quando la mutazione è insorta, cioè nelle generazioni anteriori, esempio nella terza generazione troveremmo 2 su 16 nella quarta, se avvenuta nella prima, troveremmo 8 su 16. Il concetto di base è che se la teoria della mutazione spontanea è corretta, allestendo diverse colture in duplicato, il numero di cellule resistenti della quarta generazione fluttuerà, perché la mutazione a resistenza a T1 avvenuta casualmente nella popolazione e non necessita del contatto con il fago. I due scienziati trovarono un alto grado di fluttuazione, prova che la resistenza fosse dovuta a un evento di mutazione casuale e  non ad adattamento.

Definizione di mutazione

La mutazione è il processo che altera la sequenza di basi nel DNA. Una mutazione, quindi, è un cambiamento di una coppia di basi del DNA o un cambiamento in un  cromosoma.

• Mutazione somatica: se una cellula mutata dà origine solo a cellule somatiche, le caratteristiche si avranno solo nell’individuo e non nella progenie.
• Mutazione nella linea germinale:mutazione che si trasmette per via sessuale, dando origine ad un individuo mutato

Dobbiamo considerare una misura quantitativa delle mutazioni, infatti avremo :

• Tasso di mutazione: cioè la probabilità di un particolare tipo di mutazione in funzione del tempo
• Frequenza di mutazione: cioè i numero di casi di un particolare tipo di mutazione espresso come proporzione di cellule o individui, esempio numero per 100.000 individui o numero per un milione di gameti.

Tipi di mutazione

Le mutazioni puntiformi, che alterano una o poche basi possono essere divise in due grandi categorie,: le sostituzioni di coppie di basi e le inserzioni o delezioni di coppie di basi.

• Mutazione per transizione: sostituzione una coppia purina-pirimidina con un’altra coppia purina-pirimidina. I quattro tipi ti transizione sono: AT-GC; GC-AT; TA-CG; CG-TA
• Mutazione per trasversione: sostituzione di una coppia purina-pirimidina con una coppia pirimidina- purina. Esempio: AT-TA; TA-AT; GC-CG; CG-GC; ST-CG; CG-AT; GC-TA; TA-GC

Le mutazioni per sostituzione di coppie di basi possono ssere definite a seconda dell’effetto che hanno sulla sequenza aminacidica e a seconda del cambiamento della proteina.

• Mutazione missenso: sostituzione di una coppia di basi causa un cambiamento nel codone dell’mRNA, con il risultato che nel polipeptide viene inserito un aminoacido differente. Il fenotipo potrà cambiare o menoa seconda dell’aminoacido inserito.
• Mutazione nonsenso: mutazione che determina nell’mRNA un cambiamento del codone in un aminoacido dei terminazione (UAG;UAA;UGA).
• Mutazione neutra: è una sostituzione di una coppia di basi in un gene che non determina alcuna alterazione nella funzionalità della proteina prodotto
• Mutazione silente: è uno speciale caso di mutazione missenso, che si verifica quando un codono nell’mRNA viene cambiato in modo tale da codificare ancora per lo stesso aminoacido
• Mutazione frameshift: quando si ha un aggiunta o delezione di un a base che il più delle volte porta a codificare per una proteina non funzionante. Spesso queste mutazioni producono  dei gameti di stop.

Reversioni e mutazioni di tipo soppressore

Le mutazioni puntiformi possono essere divise in due classi in base ai loro effetti sul fenotipo:

• Mutazioni in avanti: che causano un cambiamento genotipico in direzione dal selvatico al mutante
• Mutazione per reversione: causano un cambiamento genotipico in direzione dal mutante a selvatico

Se la reversione riporta a codificare l’aminoacido originale presente nel selvatico, la mutazione è una vera reversione, altrimenti si ha una reversione parziale, con un aminoacido diverso che può, però, restaurare la funzionalità completa o parziale della proteina. Gli effetti di una mutazione possono essere diminuiti o aboliti da una mutazione soppressione , che è una mutazione in un sito diverso da quello della mutazione originaria. Questa maschera o compensa gli effetti della prima mutazione.

Le mutazioni possono avvenire all’interno dello stesso gene, cioè  soppressori intragenici o in un gene diverso, intergenici.

Mutazioni spontanee 

La mutagenesi può avvenire sia spontaneamente che indotta. Tutti i tipi di mutazione puntiformi possono avvenire spontaneamente, esse possono avvenire durante la replicazione o nelle fasi G₁ e G₂ del ciclo cellulare. Nell’uomo il tasso di mutazione spontanea di geni singoli varia tra 10^-4 e 4x10^-6. La maggior parte degli errori vengono corretti da sistemi di riparazione della cellula. Durante la replicazione possiamo avere sia delezione che inserzione di basi.

• Mutazione per sostituzione di coppie di basi :possono avvenire durante un appaiamento errato del DNA durante la replicazione. L’appaiamento vacillante può avvenire perché le basi sono coinvolte in un appaiamento incorretto, in cui la base normale è appaiata ad un partner scorretto a causa di una differente posizione spaziale degli atomi che forlmano il legame indrogeno. Come si può produrre una mutazione da GC ad AT a causa di un appaiamento vacillante? Quando il DNA parentale si sta replicando, una guanina dell’elica parentale può appaiarsi in un modo vacillante ad una timina, dando luogo ad un appaiamento GT dopo la replicazione. Nel successivo ciclo di replicazione, la G probabilmente si appaierà normalmente a dare una coppia GC, mentre la con una A a dare una coppia AT nel nuovo DNA, ecco visto una transazionio da GC a AT

• Inserzione e delezione:: durante la replicazione possono avvenire spontaneamente piccole inserzioni o delezioni, ciò avviene, generalmente, dove vi sono ripetute sequenze di una base. Se la DNA polimerasi sintetizza una o più basi che non sono presenti nell’elica stampo, il nuovo DNA avrà un’inserzione. Caso opposto per quanto riguarda la delezione. Ciò porta ad una mutazione frameshift.

• Cambiamenti chimici spontanei: due dei più comuni eventi chimici che portano alla produzione di mutazioni spontanee sono la depurinazione e la deaminazione di particolari basi, questi eventi creano lesioni che sono siti danneggiati all’interno del gene. Nella depurinazione una pirina, adenina o guanina, viene rimossa dal DNA quando si rompe il legame tra essa e il desossiribosio.in suo luogo verrà inserita una base scelta a caso, che potrà produrre una scelta a caso che potrebbe portare ad un appaiamento errato. La deaminazione è la rimozione di un gruppo aminico da una base, per esempio la deaminazione della citosina porta all’uracile. Tuttavia se l’uracile non viene rimosso, porterà alla sintesi di un’adenina nella nuvoa elica di DNA durante la replicazione, determinando una conversione della coppia di basi CG una TA per transizione.

Mutazione indotte

Le  mutazioni possono essere indotte esponendo gli organismi a mutageni fisici o chimici

• Radiazoni a raggi X: I raggi X sono tipi di radiazioni ionizzanti, che penetrano nei tessuti e collidono con le molecole, spostando gli elettroni dalla loro orbita, creando ioni, che possono rompere i legami covalenti, compresi quelli zucchero-fosfato dello scheletro del DNA. Nell’uomo l’effetto ionizzante è cumulativo.
• Radiazioni ultraviolette (UV): non hanno alcuna energia sufficiente per produrre ionizzazione, tuttavia causano mutazioni perché le basi puriniche e pirimidiche assorbono molto fortemente le sue lunghezze d’onda (256-260nm). Ciò porta mutazioni puntiformi a causa di cambiamenti fotochimici. Uno degli effetti è la formazione di legami chimici anomali tra molecole di pirimidine adiacenti sulla stessa elica o nell’elica opposta, legami chiamati  dimeri di timina, con conseguenze di postruzione del DNA.
•   Mutageni chimici: includono sia sostanze chimiche che naturali. Qui parleremo di due tipologie, gli analoghi delle basi e agenti che modificano le basi. Gli analoghi delle basi sono molto simili alle basi del Dna, e questi stai alternativi si chiamano tautomeri. Un analogo comune è il5-bromouracile (5BU), che ha un residiuo di bromo al posto del gruppo metilico delle timina. Esso si appaia al DNA al posto della timina e cambia ad una tautomeria. Un 5BU incorporato si appaia all’adenina durante la replicazione del DNA si appaierà con la guanina. Nel successivo ciclo di replicazione  la coppia 6BU-G darà luogo  a una coppia C-G  invece di  T-A, producendo così una mutazione per transizione. Gli agenti che modificano le basi, sono sostanze che modificano direttamente la struttura chimica e le proprietà delle basi. Dalla figura vediamo tre tipi di mutageni, 

1. un  agente dea minante,  che rimuovo i gruppi aminici(-NH₂) dalle basi guanina, citosina e adenina. Con la guanina si produce la xantina, ma avendo le stesse proprietà  della guanina non ha effetti mutageni. Con la citosina, invece, viene prodotto l’uracile che si appaia con l’adenina producendo una transizione da CG a TA. Con l’adenina si viene a creare l’ipoxantina, una base che si appaia co la timina dando luogo ad una mutazione per transizione da AT a GC.
2. un agente idrossilante: l’idrossalina (NH₂OH) reagisce specificatamente con la citosina, modificandola per aggiunta di un gruppo idrossilico (-OH), così che essa può appaiarsi solo con adenine invece che guanina, cioè  mutazioni per transizioni da CG a TA.
3. un agente alchilante: il metilmetansulfonato (MMS) introduce gruppi alchilici (-CH₃, -CH₂CH₃) sulle basi in un certo sito. Molte mutazioni indotte dagli agenti alchilanti sono dovute all’aggiunta di gruppi alchilici all’ossigeno in posizione 6 della guanina, a produrre O⁶-metilguanina che si appaia con la timina invece che con la citosina, dando luogo a transizione da GC a AT.

• Agenti intercalanti: quali la proflavina, l’acridina, il bromuro d’etidio (usato nell’elettroforesi) si intercalano tra le basi adiacenti in una o entrambe le eliche del DNA. Esse sono molecole sottili, appiattite e idrofobighe.  Se l’gente intercalante si inserisce tra due coppie di basi adiacenti di un’elica di DNA, che serve da stampo per la sintesi del nuovo DNA verrà inserita una base a caso, (es G) in più nel nuovo DNA in corrispondenza dell’agente intercalante. In seguito ad un ulteriore ciclo di replicazione, dopo che l’agente intercalante è stato perso avremo una coppia di base casuale inserita, es G-C,. come risultato finale avremo un frameshift.
• Mutazioni sito-specifica in vitro del DNA: le mutazioni spontanee o indotte non avvengono i geni specifici, esse sono distribuite a caso. Con l’avvento della tecnologia del DNA ricombinante è possibile clonare i geni e produrre grandi quantità di un dato DNA per l’analisi e la manipolazione. Ciò significa che possiamo mutare un gene in posizioni specifiche attraverso la mutagenesi sito-specifica in vitro e poi riprodurre il gene mutato nella cellula per infezione o trasformazione ed esaminare il gene gli effetti della mutazione in vivo. Questa tecnica ha permesso di studiare geni di funziona ignota e sequenze specifiche coinvolte nella regolazione dell’espressione genica. L’autore di questa tecnica fu Michael Smith (prese il Nobel). Vi sono diverse procedure per questa tecnica, in una si usa la PCR. Vengono utilizzati quattro primer, il primo viene messo a sinistra il secondo all’estremità destra. Gli altri due (1M e 2M) sono complementari al DNA bersaglio in cui si vuole creare la mutazione. Viene fatta una PCR con i quattro primer, poi i primer vengono rimossi, e i due prodotti A e B, ottenuti dalle due prime PCR vengono mischiati, denaturati e riassociati. In alcuni casiuna molecola a singola elica di A può appaiarsi con na sincgla di B. La DNA polimerasi potrò quindi allungare  le estremità 3’ della molecola, creando un DNA a doppia elica di lunghezza totale. Questa molecola sarà amplificata utilizzando i primer 1 e 2.

Test di ames

Molti mutageni chimici inducono mutazioni che possono dare crescita di tipo cancerogeno. Tipicamente, le mutazioni sono sostituzioni di basi  che producono mutazioni per delezione, inserzione,frameshift, mutazioni  missenso o nonsenso. Per analizzare i prodotti chimici che possono essere carcinogeni si usa il test di Ames.

Il test di Ames è un test biologico ampiamente utilizzatoper determnare se un composto è carcinogeno (in grado di induerre formazione di tumori). Il test ideato da Bruce Ames si basa sulla capacità di un carcinogeno di essere mutante, inducendo una mutazione revertante in un microrganismo che sarà utilizzato nell'esperimento.

Il test si effettua utilizzando ceppi mutati di Salmonella thiphymurium mutati. La mutazione impedisce loro di poter sintetizzare l'amminoacido istidina. L'istidina è uno dei 20 amminoacidi utilizzati dalle cellule per costruire le proteine, quindi è una molecola di fondamentale importanza per la sopravvivenza delle cellule. I microganismi vengono fatti crescere in un terreno di coltura dove l'istidina è presente in quantità limitanti (vi è abbastanza istidina da permttere solo un certo numero di divisioni cellulari).Quindi lo scopo del test è di appurare che un composto che si sospetta essere mutageno possa indurre mutazioni, tra le quali una mutazione in grado di invertire quella che rende impossibile al microrganismo di sintetizzare l'istidina. Si prepara una coltura per ogni mutageno che si vuole analizzare, e in seguito per ogni mutageno utilizzato si effettua anche un controllo con una sostanza neutra. Dalle colture potremo ottenere che :

1. Se non si ha la formazione di un certo numero di colonie la sostanza in esame non è cancerogena. Lo stesso si osserva nel controllo
2. Se la sostanza che si ritiene cancerogena, rende il microganismo capace di poter sintetizzare nuovamente l'istidina, viene considerato mutageno. 

Ci sono proprietà aggiuntive nei batteri utilizzati per il test di Ames:

1. hanno una mutazione aggiuntiva che rende la membrana esterna facilmente permeabile alle grandi molecole (in modo che il potenziale carcinogeno possa entrare nella cellula)
2. hanno una mutazione che elimina alcuni meccanismi di riparazione del DNA (BER e NER cioè rispettivamente ripro per escissione di nucleotidi e riparo per escissioni di basi)
3. viene immesso nelle ellule un plasmide che incrementa il riparo del DNA error prone (il cosiddetto riparo SOS utilizzato dai batteri)

Tutte queste mutazioni sono di fondamentale importanza perchè inducono la formazione di molte mutazioni in presenza di un presunto agente mutageno, quindi modificazioni che facilitano l'accumulazione e la fissazione delle mutazioni. Quando si parla di sostanza cancerogena (oggetto di futuro post); si deve tenere presente che in realtà non tutte sono direttamente in grado di indurre mutazioni, infatti alcuni sono cancerogeni indiretti e vengono definiti pro-cancerogeni, si tratta di composti che sono in grado di indurre tumori se subiscono modificazioni  ad opera del metabolismo cellulare. Ecco perchè viene introdotto nel terreno di coltura un estratto di fegato di ratto. 

In modo tale da poter favorire la metabolizzazione e la trasformazione di sostanze pro-carcinogene in carcinogene; trasformazione che avviene ad opera degli enzimi del fegato. Il numero di colonie che si formano è indice della forza del mutageno: tante più colonie si formeranno tanto più mutagena sarà la sostanza in esame. Si possono fare anche prove con dosi crescenti di mutageno per analizzare la mutagenicità.

Meccanismi di riparazione del dna

Le mutazione spontanee o indotte sono un danno del DNA. Sia la cellula procariote che eucariote possiedono diversi sistemi di riparazione su base enzimatica per fronteggiare  questi danni. Possiamo raggruppare i sistemi di riparazione in alcune categorie in base al modo di operare. Alcuni sistemi correggono le regioni danneggiate facendo la reversione diretta, cioè reversione del danno. Altri sistemi excidono la regione danneggiate e poi riparano il buco risintetizzando la regione mancante. In ogni caso  i sistemi di riparazione si avvantaggiano della duplicazione del DNA.

Correzzione diretta di lesioni mutazionali

Riparazioni dovute all’attività di correzione delle bozze della DNA polimerasi : nei geni batterici la frequenza di sostituzione di coppie di bsi varia da 10^-7 a 10^-11 errori per generazione. D’altra parte, la DNA polimerasi compie errori mentre sintetizza la muova elica con una frequenza di 10-5. La maggior parte della differenza tra i due valori  è dovuta all’attività esonucleasica da 3’ a 5’di correzione delle bozze (proofreading) delle polimerasi stessa. Se inserito un nucleotide errato, l’errore è scoperto dalla polimerasi stessa, la sintesi del DNA si arresta e non procede fino a quando il nucleotide sbagliato non viene sostituito. L’importanza dell’attività esonuclesica 3’ 5’ è stata dimostrata in un mutante di DNA  polimerasi in E.coli. l’attività esonuclesica 3’5’ è una proprietà della DNA polimerasi batterica, ma non si trova nelle cellule eucarioti dove è localizzata in altre proteine.

Foto riattivazione di dimeri di pirimidina indotti da UV. Vengono riparati i dimieri di timina o altre pirimidine indotti da UV (320-370nm). La foto riattivazione avviene dall’enzima fotoliasi, che attivato da un fotone di luce, rompe i dimeri.

Riparazione da danni da alchilazione:  gli agenti alchilanti trasferiscono gruppi alchilici (metilici o etilici) sulle basi in diverse posizioni, come ad esempio l’O in posizione 6. In questo caso, un particolare enzima, O⁶-metilguanina metiltransferasi, riconosce la O⁶-metiguanina nel DNA e rimuove il gruppo metilico, riportando la base alla sua forma originale.

Riparazione per excisione di una coppia di basi

Riparazione per excisione: furono isolati alcuni mutanti di E. coli sensibili ai raggi UV che doppi l’irradiamento avevano un tasso di mutazione indotta al buio superiore al normale. Chiamati uvrA possono riparare i dimeri solo in presenza di luce, cioè foto riattivazione funzionante. Tuttavia il selvatico uvrA+ può riparare al buio, quindi ci doveva essere un altro sistema, cioè sistema di excisione dei nuclotidi (NER),dove la sistemazione non avviene solo ai dimeri di pirimidina, ma anche ad altre distorsioni indotte  nell’elica del DNA. A guidare l'intero processo, interviene il complesso enzimatico UvrABC, il quale è costituito da tre subunità proteiche: UvrA, UvrB e UvrC che trovano la distorsione, tagliano il filamento danneggiato formando così un segmento di 12 nucleotidi. Successivamente, la DNA elicasi II (a volte conosciuta come UvrD in questo complesso) scinde i legami a idrogeno tra le basi complementari rimuovendo quindi l'intero segmento di 12 nucleotidi. Infine, il vuoto viene colmato dall'azione della DNA polimerasi I che usa il filamento complementare per produrre la copia, e dalla Dna Ligasi che salda la sequenza al filamento.

Il processo basico di NER è molto simile negli altri procarioti, ma a volte in alcune cellule coinvolge molte più proteine.

Riparazione degli errori di appaiamento diretta dalla metilazione: malgrado la correzione di bozze da parte della DNA polimerasi, un numero significativo di errori rimane non corretto dopo che la replicazione è stata completata. Nel nuovo  ciclo di replicazione, questi errori saranno fissati come mutazioni. La cellula usa questo sistema , excidendo le basi non correttamente e poi procede son la sinstesi ripartiva. In E.coli i prodotti di tre geni mutH, muthL emutS sono coinvolti in questo tipo di riparazione.la proteina codificata per il gene mutS si lega alle basi appaiate in modo errato. Il passo successivo richiede il riconoscimento di quale sia la base corretta e non corretta. In E coli questa distinzione avviene grazie alla metilazione nella sequenza GATC. Ambedue le eliche sono metilizzate. Tuttavia, dopo la replicazione, l’elica parentale A è ancora metilizzata, mentre la nuova elica non lo è, quindi la proteina MutS viene legata con le altre due proteine MutL e MutH formando un complesso che porta la sequenza GATC non metilata vicino al sito errato. La proteina MutH taglia il DNA , il tratto errato viene così exciso e riparato dalla DNA pol III  e ligasi.

Riparazione SOS: un danno non corretto induce una risposta chiamata SOS che permette la sopravvivenza del batterio. In E.coli due geni ccontrollatno questo sistema, lexA e recA. RecA attivata stimola  lexA che insieme riparano il DNA. Una volta che il danno è stato riparato la proteina recA è inattivata e la proteina LexA di nuova sintesi reprime i geni per la riparazione. 

spero che questo sunto sia piaciuto. Le informazioni e le immagini le ho prese sia in internet, che dallo storico libro che tutti noi conosciamo il “Russel, Genetica”